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化學發光底物的原理與用途
  • 釋出日期₪╃:2022-08-01      瀏覽次數₪╃:164
    •        辣根過氧化酶使試劑中的發光物(luminol)氧化併發光↟✘◕,而試劑中含有增強劑這使得發光增強了1000倍▩·☁。在免疫印跡中↟✘◕,將複雜的蛋白混合物經sds-page分離↟✘◕,並轉移到固相膜上(如nc✘↟▩☁、pvdf)等↟✘◕,用於免疫學檢測↟✘◕,經HRP標記的抗體與膜上的蛋白直接(標記一抗)或間接(標記二抗)反應▩·☁。

       原理

       辣根過氧化酶使試劑中的發光物(luminol)氧化併發光↟✘◕,而試劑中含有增強劑這使得發光增強了1000倍▩·☁。在免疫印跡中↟✘◕,將複雜的蛋白混合物經sds-page分離↟✘◕,並轉移到固相膜上(如nc✘↟▩☁、pvdf)等↟✘◕,用於免疫學檢測↟✘◕,經HRP標記的抗體與膜上的蛋白直接(標記一抗)或間接(標記二抗)反應▩·☁。當加入免疫印跡化學發光試劑後↟✘◕,luminol發生氧化降解↟✘◕,併發射波長為428nm的光↟✘◕,此光可經x光膠片(放射自顯影片)感光記錄下來▩·☁。

      用途

      非放射性發光系統↟✘◕,用於檢測固定在膜上的蛋白↟✘◕,其敏感性達1-5pg▩·☁。用x光片可快速地獲得永.久的硬複製結果▩·☁。所含獨.特的底物足以維持12小時以上的發光↟✘◕,便於反覆曝光操作↟✘◕,免疫印跡膜經抗體脫卸處理後可供再次抗體探查使用▩·☁。適用於痕量蛋白或核酸檢測▩·☁。

      使用方法

      1. 印跡膜製備 按常規方法完成SDS-PAGE和電轉膜操作↟✘◕,適當的封閉非常重要▩·☁。可以透過標記一抗或二抗的手段引入HRP↟✘◕,一般採用市售的HRP二抗交聯物▩·☁。仔細地淋洗對於降低背景非常重要↟✘◕,在與HRP交聯物溫育後↟✘◕,膜片更需仔細洗滌↟✘◕,所有步驟均在室溫下完成▩·☁。

      2. 化學發光試劑的配置 在使用前等量混合a液和b液↟✘◕,混合後儘快使用▩·☁。將膜片置混合液中於室溫下振盪溫育2分鐘↟✘◕,每平方釐米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆蓋全膜片▩·☁。
      3.蛋白訊號顯現
      1). 用平頭鑷鉗住膜片↟✘◕,垂直置於吸水紙以吸去過量試劑▩·☁。
      2). 置膜片於二層保鮮膜之間↟✘◕,小心趕盡氣泡▩·☁。
      3). 將膜片吸附蛋白麵朝上↟✘◕,置於x光片盒中▩·☁。
      4). 於暗室中壓上x光片▩·☁。
      5).根據訊號的強弱適當調整曝光時間↟✘◕,一般為1min或5min↟✘◕,也可選擇不同時間多次壓片↟✘◕,以達最佳效果▩·☁。顯影沖洗▩·☁。
      6). 調節曝光時間↟✘◕,再次曝光顯影▩·☁。
      4✘↟▩☁、膜的重複使用₪╃:
      配置62.5mm tris-hcl,ph6.7,2%sds, 7ml/100ml的巰基乙醇的溶液↟✘◕,膜放入後↟✘◕,70?c振盪水浴30分鐘▩·☁。再用tbst或pbst緩衝液洗脫↟✘◕,最後用bsa(牛血清白蛋白)或牛奶封閉▩·☁。


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